然而，由于膜環(huán)境與膜蛋白本身的復雜性，膜蛋白在表達、純化和表征上面臨諸多挑戰(zhàn)，導致其在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB）中的結(jié)構(gòu)數(shù)量相對較少。人們對膜蛋白折疊、定位和功能機制的理解不如水溶蛋白深入，因此跨膜蛋白的從頭設(shè)計難度更大。由于小分子結(jié)合蛋白的從頭設(shè)計問題尚未完全攻克，再加之跨膜蛋白骨架采樣的局限性以及在疏水性膜環(huán)境中構(gòu)建空腔和極性相互作用等挑戰(zhàn)，使得精確設(shè)計能夠特異性結(jié)合指定配體的跨膜蛋白成為一項懸而未決的難題。

    在這項最新研究中，研究團隊使用 Rosetta 軟件進行序列設(shè)計和優(yōu)化，結(jié)合 AlphaFold2 進行結(jié)構(gòu)預測和驗證。首先設(shè)計了一個穩(wěn)定的四螺旋束結(jié)構(gòu)的水溶性熒光激活蛋白（wFAP），該蛋白具有一個中央口袋，能夠結(jié)合并激活熒光配體（HBC599），其中 wFAP1.1 和 wFAP1.2 變體表現(xiàn)出較高的熒光激活能力和結(jié)合親和力，與 HBC599 的親和力達到納摩爾級別，使其熒光亮度激活超過 1600 倍，結(jié)合態(tài)的亮度和量子產(chǎn)率均優(yōu)于常用的增強型綠色熒光蛋白（EGFP）。

    在 wFAP 的基礎(chǔ)上，研究團隊通過重新設(shè)計表面氨基酸殘基，將其轉(zhuǎn)化為跨膜蛋白，同時盡量減少對配體結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)的擾動。使用 ColabDesign 框架進行跨膜序列的生成，結(jié)合AlphaFold2 進行結(jié)構(gòu)預測和優(yōu)化，從而設(shè)計出了跨膜熒光激活蛋白（tmFAP）。其中，tmFAP1.2 變體表現(xiàn)出最高的結(jié)合親和力和量子產(chǎn)率。冷凍電鏡結(jié)構(gòu)驗證顯示，這些蛋白的結(jié)構(gòu)與設(shè)計模型高度一致。研究團隊還在活細菌和真核細胞中表達了這些設(shè)計的 tmFAP 蛋白，結(jié)果顯示，這些蛋白在細胞中表達后會自發(fā)定位到細胞膜組分中，并能夠特異性激活熒光配體（HBC599）的熒光，且在膜環(huán)境中表現(xiàn)出較高的亮度和量子產(chǎn)率。

    該研究采用深度學習方法，解決了設(shè)計跨膜區(qū)時引起的核心結(jié)構(gòu)及配體結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)擾動問題，實現(xiàn)了小分子結(jié)合跨膜蛋白的精確設(shè)計，為跨膜蛋白的從頭設(shè)計提供了新范式。該方法使小分子結(jié)合跨膜蛋白的設(shè)計不再依賴天然蛋白骨架，且可針對任意小分子進行設(shè)計，為定制化功能的跨膜蛋白從頭設(shè)計奠定了基礎(chǔ)，如轉(zhuǎn)運體蛋白及配體門控離子通道等。此外，可以沿用設(shè)計 tmFAP 的思路，進一步開發(fā)可遺傳編碼的生物探針。在膜蛋白穿膜區(qū)設(shè)計熒光化學探針結(jié)合位點，使其響應(yīng)膜兩側(cè)的物理或化學信號。這種生物探針不僅具有膜蛋白可控表達的組織和位置特異性優(yōu)勢，還兼具化學探針的高靈敏度和高信噪比特性，在檢測跨膜電壓和 pH 梯度等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。